• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1992006381A1
    申请号:PCT/JP1991/001308
    申请日:1991-09-27
    公开日:1992-04-16
    发明作者:Shigenori Tanaka；Jun Aketagawa；Yuko Shibata
    申请人:Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 カブトガニ · ァメボサイ ト · ライセ一 卜の調製法
    [0002] [技術分野]
    [0003] カブトガニ · ァメボサイ ト ライセ一 トの調製法に関する。
    [0004] [背景技術]
    [0005] カブトガ二の血球細胞抽出液 （以下、 LA Lと記す。 ） 力 細菌性発熱物質である内毒素 （以下、 エン ド トキシンと記す。 ：) と反応して凝固することが広く知られている。
    [0006] この反応を基礎として、 種々のエン ド トキシン検出方法が開 発されている。
    [0007] 最近になって、 第 1図に示すような段階的反応でコアギュロ 一ゲンがコアギュ リ ンとなって凝固 （ゲル化） すると言う上記 凝固反応の機構が解明された [S. Iwanaga et al. , The hemolymph coagulation system in invertebrate animals, J. Protein Chem. , 5, 255-268(1986) ]0 この機構によれば、 LALの凝固は、 エン ドトキシンによって、 開始する系 （C因 子系） と、 （ 1— 3 ) — /S— D—グルカン' （例えば、 力一 ドラ ン、 部分カルボキシメチル化 （ 1→ 3 ) — /3— D—グルカンな ど） によって開始する系 （G因子系） とが存在することが理解 される。
    [0008] 本発明者等は、 先に特定の分子量を有する （ 1→ 3 ) — β — D—グルカン構造体は、 L A Lの （ 1→ 3 ) — ^一 D—グルカ ンによって反応が開始する系 （G因子系） の活性化を阻害する ことを発見し、 カブトガ二 ' ァメボサイ ト · ライセー ト G因子 活性化阻害剤として特許出願を行った （特願昭 63— 216341号及 び WO 90/02951号） 。
    [0009] しかし、 エン ド トキシンに特異的な L A Lを得る目的で、 こ の阻害剤を L A Lに添加した場合、 L A L中には阻害剤と G因 子の複合体が残されており、 加える検体によっては複合体が解 離し、 遊離した G因子が G因子活性化物質によって活性化され る危険性がある。
    [0010] [発明の開示]
    [0011] 本発明は、 L A Lの凝固機構において、 （ 1→ 3 ) — β - Ό 一ゲル力 ンによつて最初に活性化される G因子を含まない LAL の提供をその目的とするものである。
    [0012] すなわち、 本発明によれば、 式 [ I ]
    [0013]
    [0014] (式中、 ηは 2〜 3 7 0の数を表す）
    [0015] で示される （ 1→ 3 ) — /S— D—グルコシ ド構造体を不溶性担 体に固定化して得られる不溶性固定化物に、 カブトガニ ' ァメ ボサイ ト · ライセー トを接触させることを特徴とする実質的に G因子を含まないカブトガニ · ァメボサイ ト ライセー トの調 製法を要旨とするものである。
    [0016] 本発明において使用される （ 1 → 3 ) 一 β D—グルコシ ド 構造体は、 下記式
    [0017]
    [0018] で示される （ 1 → 3 ) — 5— D—グルコシ ド構造単位 （分子量 : 1 6 2 ) が連続して 2〜 3 7 0個、 好ま しく は 3〜 3 1 0個. より好ま しく は 4〜 1 8 0個結合したポリ — （ 1 → 3 ) — β — D—グルコシ ド構造部分 [以下、 ポリ （ 1 → 3 ) グルコシ ド構 造部分という ] を 1 分子中に少なく とも 1 つ含有するポリ グリ コシ ドである。
    [0019] かく して、 本発明で使用されるポリ グリ コシ ドは、 ポリ （ 1 → 3 ) グルコシ ド構造部分を 1 分子中に少なく とも 1 つ含有す ることが必要である。 例えば、 本発明で使用されるポリ グリ コ シ ドは、 実質的に 1 つのポリ （ 1 → 3 ) グルコシ ド構造部分か らなるもの、 例えば下記式
    [0020] 式中、
    [0021] nは 2〜 3 7 0、 好ましく は 3〜 3 1 0、 より好ましく は 4
    [0022] 1 8 0の整数である、
    [0023] で示されるポリ 一 （ 1 → 3 ) — /S— D—グルコシ ドであること ができ、 また 1 つのポリ （ 1 → 3 ) グルコシ ド構造部分に、 下 記式
    [0024]
    [0025] で示される （ 1 → 4 ) 一 /6— D—グルコシ ド構造単位の 1 つも しく はそれ以上又は下記式
    [0026] で示される （ 1 → 6 ) — yS— D—グルコシ ド構造単位の 1 つも しく はそれ以上又は下記式
    [0027]
    [0028] ）
    [0029] 式 （1 、 (V) 、 (VT) 中、
    [0030] R j 、 R 2 及び R 3 の少く とも 1 つはメチル基、 ヒ ドロキシ メチル基などのヒ ドロキシアルキル基 ； カルボキシメチル基 な 'のカルボキシアルキル基 ； ァセチル基、 硫酸基、 リ ン酸 基、 ァリル基等化学的に導入し得る官能基およびそれらの金 属塩、 アンモニゥム塩及び有機アミ ン塩から選ばれる残基を 表わし、 そして残りは水素原子を表わす、
    [0031] で示される修飾された /3 — D—グルコシ ド構造単位の 1 つもし く はそれ以上から構成される糖鎖が結合した [この糖鎖は前記 ポリ （ 1 → 3 ) グルコシド構造部分に分岐鎖として結合してい てもよい] 構造のものであってもよい。
    [0032] さらにまた、 本発明で使用するポリ グリ コシ ドは、 2つ又は それ以上の前記ポリ （ 1 → 3 ) グルコシ ド構造部分が、 他の糖 鎖構造部分を狭んで下記式
    [0033] Α ί - Β ι - Α 2 - Β 2 - 式中、
    [0034] A , 、 Α 2 、 …はそれぞれ前記式 （ I ) で示される （ 1 → 3 ) — β — Ό -グルコシ ド構造単位が連続して 2〜 3 7 0個、 好 ましく は 3〜 3 1 0個、 より好ましくは 4〜 1 8 0個結合し たポリ 一 （ 1 → 3 ) — 8 — D—グルコシ ド構造部分を表わし、 Α ι 、 Α 2 、 …の各構造部分を構成する式 （ I ) の単位の数 は互に異なっていてもよく、 そして 、 B 2 、 …は各々同 一もしく は相異なる他の糖鎖構造部分を表わす、
    [0035] で示されるように連結した構造のものであってもよい。 ここで、 、 B 2 、 …によって表わされる他の糖鎖構造部分としては、 例えば前記式 （ H ) 、 (IK) 、 ( ) 、 (V) 又は で示 される構造単位の 1個又は 2個以上のプロックからなる構造部 分が挙げられる。
    [0036] さらにまた、 本発明で使用するポリ グリ コシ ドは、 前記ポリ ( 1 → 3 ) グルコシ ド構造部分が、 上記 B , 、 B 2 、 …によつ て表わされる如き他の糖鎖構造を狭んで前記式 （ I ) で示され る （ 1 → 3 ) — /S— D—グルコシ ド構造単位が連続して 3 7 1 個以上結合した長鎖のポリ 一 （ 1 → 3 ) — / S— D—グルコシ ド 構造部分が連結した構造のものであってもよい。
    [0037] 従って、 本発明で使用されるポリ グリ コシ ドは前記ポリ （ 1 ― 3 ) グルコシ ド構造部分を 1 分子中に少なく とも 1 つ含有す るものであることを必須とするものであって、 その分子量は特 に制約されるものではない。
    [0038] また、 本発明で使用されるポリ グリ コシ ドは前記のポリ （ 1
    [0039] → 3 ) グルコシ ド構造部分を 1 分子中に少なく とも 1 つ含有す るものから実質的になるこ とが好ましいが、 しかし必ずしもそ うである必要はなく、 例えば、 前記式 （ I ) で示される （ 1 → 3 ) 一 /3 _ D—グルコシ ド構造単位が連続して 3 7 1個以上結 合した高分子量のポリ 一 （ 1 → 3 ) — /S— D—グルコシ ド構造 部分を含有する他のポリ グリ コシ ドが混在していてもよい。 何 んとなれば、 本発明によるポリ グリ コシ ドは、 L A Lの G因子 活性化系の開始因子である G因子に、 G因子活性化物質である 高分子量のポリ 一 （ 1 → 3 ) — / S— D—グルコシ ドより も速く 強く結合して活性型 G因子への活性化を阻害し、 かかる高分子 量のポリ — （ 1 → 3 ) — — D—グルコシ ドの存在によってそ の阻害作用に実質的な影響がないからである。
    [0040] なお、 本明細書においてポリ グリ コシ ドの分子量は、 分子量 既知の標準物質を用い下記の条件でゲルパー ミエイシヨ ンクロ マ トグラフィ ーを行ない標準曲線を作成し、 次に供試試料につ いて同じ条件でクロマ トグラフィーを行ない、 その結果を標準 曲線と対比することにより求めた値である。
    [0041] カラム ： TSKgel G - PWXLシリ一ズ （東ソ一株式会社） 7. 8 X 3 0 0讓数種数本
    [0042] 移 動 相 ： 0. 3 MN a O H
    [0043] 流 速 ： 0. 5 ηβ/min
    [0044] 試料溶液濃度.： 0. 1 - 5 mg/τηβ
    [0045] 試料溶液注入量 ： 0. 1
    [0046] 力ラム温度 ： 室温
    [0047] 検出法 ： 示差屈折計 （L K B社） による測定又はフエノー ル硫酸法による糖定量
    [0048] 標準物質 ： T S K標準ポリエチレンォキシ ド （東ソ一株式 会社） およびポリエチレングリ コール （半井化 学薬品株式会社） の重量平均分子量が 1, 000か ら 860， 000 の 1 0種を使用。
    [0049] 本発明において用いられる上記の如き特性をもつポリ グリ コ シドは、 天然に由来するものであってもよく、 或いは合成され たもの又は前記式 （ I ) で示される （ 1 → 3 ) —；8— D—グル コシド構造単位を 3個以上含有するポリ （ 1 → 3 ) - β - Ό - グルコシ ドの一部を化学的に修飾したものであってもよい。 通 常は天然に由来するものの方が人手容易である。 そのようなポ リ グリ コシ ドの具体例としては以下に記載するものが挙げられ る ο
    [0050] (1) 前記式 （ I ) で示される （ 1 → 3 ) — 一 D—グルコシ ド構造単位のみから実質的になる実質的に直鎖状のポリ グルコ シ ド ： 例えば、 アル力 リゲネス属 （Alcaligenes)バクテリア由 来の （ 1 → 3 ) — /3— D—グルカン ； 鞭毛藻 （Euglena)由来の パラ ミ ロン ； 高等植物の繊維組織の /3—グルカン又は篩管から 抽出されるカロース ； 上記 （ 1 — 3 ) — β — Ό — ゲルカ ンや Laminaria (コンブ属） 、 Eisenia (ァラメ属） 等の褐藻類由 来のラ ミ ナラン類等の部分水解物中に含まれる高重合度の （ 1 → 3 ) - /S—結合からなる D—グルコース重合体 ； ラ ミ ナリデ キス ト リ ン （重合度 1 0〜 2 0のもの） 、 ラ ミ ナリオリゴ糖 (重合度 1 0以下のもの） 、 等。
    [0051] (2) 前記式 （ I ) で示される （ 1→ 3 ) — /5— D.—グルコシ ド構造単位と前記式 （m) で示される （ 1 → 6 ) — ^一 D—グ ルコシ ド構造単位の両者を含有するポリ グリ コシ ド ： 例えば、 a ) ( 1 → 3 ) 一 /3—結合からなる主鎖に 1 〜数個の （ 1 → 6 ) - y3一結合が連鎖したグルコース又はグルコース重合体が 組込まれたもの、 例えば、 Eisenia (ァラメ属） 褐藻類由来の ラ ミ ナラン類。
    [0052] b ) 上記 a ) の （ 1 → 3 ) — β一結合で連鎖したグルコース 又はグルコース重合体にさらに （ 1 — 3 ) — /3—結合の糖鎖が ( 1→ 6 ) 一 / S—結合で分岐し、 また特に糖鎖の一部に他の糖 部分を含みうるもの、 例えば、 Laminaria (コンブ属） 褐藻類 由来のラ ミ ナラン類、 Ochrjno^ (ォクロモナス） 、
    [0053] Phaeodactylum (ファ工オダクチラム） ゝ Sk_eletonema (スケ レ 卜 ネマ） 、 Biddulphia ( ビデュ ノレフ ィ ァ ) 、 Cosci nodi scus (コシノデイ スカス） 、 Chaetoceros (カェ トセロス） 等の珪 藻由来のク リ ソラ ミ ナラン類、 Poria (ブク リ ヨゥ菌） 由来の パキマン等。
    [0054] c ) さらに多くの分岐をもち、 樹状構造を有する子囊菌、 担 子菌、 および藻菌類の細胞壁を形成する yS—グルカ ン、 例えば
    [0055] Phytophthora (フィ トフソラ） の細胞壁由来のグルカン、 等。
    [0056] d ) ( 1→ 3 ) — ー結合よりなる直鎮状グルカ ンに （ 1 →
    [0057] 6 ) — S—結合でグルコースが連結しているもの、 例えばグル コース単位 3残基当り 1残基の割合で分岐のある Sclerotinia (スク レロチニァ） 由来のスク レ口タン、 Schizophyllum (スェ ヒロタケ） 由来のシゾフイ ラン、 Grifola frondosa (マイタケ） 由来のグリ フオラン LE、 Sclerotium (スク レロチウム） 、
    [0058] Corticiura (コルチシゥム） 、 Stromatinia (ス ト口マチニァ） 等に由来するスク レログルカン類等。 また、 （ 1→ 3 ) - β - 結合よりなる直鎖状グルカンのグルコース単位 5残基当り 2残 基の割合で （ 1→ 6 ) — β一結合でグルコースが結合している もの、 例えば、 し entinus (シィタケ） 由来のレンチナン、 等。
    [0059] e ) ( 1→ 6 ) 一 /8—結合よりなる直鎖状グルカンのグルコ —スの C— 3位から （ 1→ 3 ) — ^—結合でグルコース鎖が複 数分岐しているもの、 例えば、 Saccharomyces (パン酵母） の細 胞壁由来の / δ—グルカン、 等。
    [0060] (3) 前記式 （ I ) で示される （ 1→ 3 ) — yS— D—グルコシ ド構造単位と前記式 （H) で示される （ 1→ 4 ) — β — Ό— ゲ ルコシ ド構造単位の両者を含有するポリ グリ コシド ： 例えば、 Cetraria (セ 卜ラ リア） 、 Usnea (ウスネア） 、 Evernia (ェ ヴエルニァ） 等に由来する リ ヒェナン類、 ォォムギ胚乳中に含 まれる —グルカン等の （ 1→ 4 ) — S—オリゴグルコシ ドが ( 1→ 3 ) — /3—結合により連結した糖鎖構造からなるもので、 所々に （ 1→ 3 ) — /3—オリゴグルコシ ド構造を含むもの。
    [0061] 以上に述べたポリ グリ コシ ドの或る種のものは市販品として 入手することができ、 それらはそのまま利用することができる が、 必要に応じて、 糖類を部分的に分解し及び Z又は分別処理 に付して、 前記式 （ I ) で示される （ 1→ 3 ) — /3 _ D—グル コシ ド構造単位を前記特定量で含有するポリ グリ コシ ドに富む 画分を調製し、 それを利用してもよい。
    [0062] かかる糖鎖の部分的分解及び分別処理はそれ自体既知の方 法で行なう こ とができる。 例えば、 糖鎖の部分分解は酸また はアルカ リ、 ーグルカナ一ゼを用いる加水分解、 加酢分解 (acetolysis). 音波処理等により行うことができる。 また分子 量分画は、 アルコール、 アセ ト ン、 エーテル等の有機溶媒や塩 類を用いる分別沈澱法、 分子篩剤や分子篩膜を用いる分画によ り行う ことができる。
    [0063] また、 上記 (1)〜 )に例示した如きポリ グリ コシ ドは、 糖鎖の 一部を、 メチル基のようなアルキル基、 ヒ ドロキシメチル基の ようなヒ ドロキシアルキル基、 カルボキシメチル基の如きカル ボキシアルキル基、 ァセチル基、 硫酸基、 リ ン酸基などの酸基、 その他の官能基によって化学的に修飾されていてもよい。 それ らはそれ 体既知の方法でかかる官能基を導入することによつ て調製することができる [例えば、 （1)安藤、 寺山、 西沢、 山川 編、 生化学研究法 I、 2 8 4〜 3 0 3 ( 1967) 、 朝倉書店、 （2) Whistler, . L. ed.； Methods in Carbohydrate Chemistryl , 1 9 3〜 2 6 7, 2 7 1〜 3 3 1 ( 1964) ， Academic Press等 参照] 。 特に、 G因子活性化作用をもつ分子量が約 60, 000以上 の （ 1 → 3 ) — /S— D—グルカンは部分的な化学的修飾によつ て、 そのポリ 一 （ 1 → 3 ) — 3— D—グルコシド構造部分にお ける前記式 （ I ) で示される （ 1 → 3 ) — /S— D—グルコシ ド 構造単位の連続結合数を 3 7 0個以下にすることにより、 使用 できるようになる。
    [0064] しかして、 本発明において好適に使用しうるポリ グリ コシ ド の具体例を示せば次のとおりである。
    [0065] 分子量 3 4 2〜1， 638 のラ ミナリオリゴ糖、
    [0066] 分子量 1, 800 〜3，258 のラ ミナリデキス ト リ ン、
    [0067] 平均分子量 2, 000〜60, 000の （ 1 → 3 ) — 5— D—グルカ ン、 平均分子量 3， 000〜23, 000のラ ミナラン、
    [0068] 平均分子量 3, 000〜20, 000のスク レロタン、
    [0069] 平均分子量 500， 000以下のシゾフイ ラン、
    [0070] 平均分子量 1, 100, 000以下のレンチナン、
    [0071] 平均分子量 12， 000以下のパン酵母グルカン水可溶物、 平均分子量 33， 000以下のリ ヒェナン、
    [0072] 平均分子量 200， 000以下の大麦 ーグルカ ン、
    [0073] 例えばカー ドランの部分カルボキシメチル化により得られる 平均分子量 40， 000〜240， 000 の部分カルボキシメチル化 （ 1 → 3 ) — /3— D—グルカンおよびその塩 （置換度 ： 0.003〜 1.0)、
    [0074] 平均分子量 23, 000以下の部分カルボキシメチル化ラ ミ ナラン およびその塩 （置換度 ： 1. 0以下） 、
    [0075] 平均分子量 80， 000以下の部分メチル化 （ 1 → 3 ) - β - Ώ - グルカ ン （置換度 ： 0. 0 0 3〜 1. 0 ) 、
    [0076] • 平均分子量 23， 000以下の部分硫酸化ラ ミ ナランおよびその塩 (置換度 ： 1. 0以下） 。
    [0077] 以上に述べたポリ （ 1 → 3 ) グルコシ ド構造部分を有する ( 1→ 3 ) — ^一 D—グルコシ ド構造体を固定化するために用 いられる不溶性担体としては水酸基や力ルバモイル基などの親 水性の基を有する不溶性担体であれば何れも使用可能である。 これら不溶性担体としてはセルロース （例えばセルロースパゥ ダー （ァ ドバンテツ ク東洋販売） 、 セル口ファ イ ン （生化学ェ 業販売） 、 アビセル （フナコシ薬品販売） 、 セレ ッ クス （バイ オラ ッ ド販売） など） 、 ァガロース （例えばセファロ一ス （フ アルマシア販売） 、 バイオゲル Α (バイオラ ッ ド販売） 、 ク口 マゲル A (同仁化学販売） 、 サガバッ ク （セラバッ クラボラ ト リーズ販売） 、 ゲラロース （リテッ クス販売） 、 P— Lァガロ —ス （ P— Lバイオケミカルズ販売） など） 、 架橋デキス トラ ン （例えばセフ アデッ クス G、 セフ ア ク リ ル （フ アルマシア販 売） 、 P— Lデッ クス （ P— Lバイオケ ミ カルズ販売） など） 、 ポリ アク リ ルア ミ ド （例えばバイォゲル P (バイオラ ッ ド販 売） 、 ク ロマゲル P (同仁化学販売） など） 、 多孔質ガラス (例えばバイオグラス （バイオラッ ド販売） など） 、 親水性ポ リ ビニル系合成ポリマ一 （例えばトョパール （東ソ一販売） な ど） などが挙げられる。
    [0078] これらの不溶性担体に （ 1→ 3 ) — ^— D—グルコシ ド構造 体を固定化するためには不溶性担体を活性化する必要がある。 この方法としては、 種々のものがあり、 例えば、 水酸基を有す る担体に対しては、 臭化シアンによる方法 （ Axen, J.
    [0079] Porath.. and S, Ernback, Nature, 2 1 4 , 1302(1967 ) ゃォ キシラン類による方法 （J. Porath and N. Fornstedt, J.
    [0080] Chromatogr.， 5 1， 4 7 9 ( 1970) および L. Sundberg and J. Porath, J. Chromatogr. , 9 0， 8 7 ( 1974) ) 、 又、 力ルバ モイル基を有する担体に対しては、 アルキルジァミ ンを用いて アミ ノアルキルア ミ ン誘導体とする方法やヒ ドラジンを用いて ヒ ドラジ ド誘導体とする方法 （共に、 J. K. Inman and H. M. Dintzis, Biochemistry, 8 , 4074 ( 1969) ) などが挙げられ るが、 安定でかつ非特異的吸着の少ない方法としては、 ェピク ロルヒ ドリ ンゃビスォキシラン類を用いてエポキシ活性化し、 得られたエポキシ活性化不溶性担体を更に抱水ヒ ドラジンある いはジヒ ドラジド化合物と反応させて得たヒ ドラジン誘導体ま たはヒ ドラジ ド誘導体を活性化体として用いる方法 （松本勲武 ら、 特開昭 59- 15401) が優れている。
    [0081] 本発明の調製法において使用する L A Lとしては、 カプトガ 二の血球から抽出されたものでェン ドトキシンとの反応でその C因子系が活性化されるものであれば特に限定されることなく 挙げられる。 これには、 L A Lの凍結乾燥品や L A Lに合成基 質を加えたものの凍結乾燥品などの市販されているものも挙げ ることができる。
    [0082] 各種市販のライセー トを示せば次のとおりである。 プレゲル. プレゲル一 S、 プレゲル一 M、 ハ 'イロディ ッ ク、 トキシカラ一 (以上、 生化学工業販売） 、 リ ムルス！ [—テス トヮコ一、 リ ム ルス I一シングルテス トヮコ一、 リ ムルス H S I—テス トヮコ 一、 リ ムルス H S丑—シングルテス トヮコ一、 リ ムルス S E— シングルテス トヮコ一、 力ブトガニ血球抽出物 E (凍結乾燥品）、 カブ卜ガニ血球抽出物 - H S H (凍結乾燥品） （以上、 和光純 薬工業販売） 、 パイ口テル （ケープコッ ド社販売） 、 パイロセ — ト （へマケム社販売） 、 パイロジェン ト ®、 ノ、。ィロジェン ト ®プラス、 ノ ィロジェン ト ®シングルテス ト、 ノ、。 イ ロジェン ト ®マルチテス ト、 L A Lシングルテス トキッ ト、 Q C L — 1000、 力イネティ ッ ク Q C L TM (以上、 ウイ ッテ一力一 ' バイオプロ ダクッ社販売） 、 コーテス ト ®エン ドトキシン （力ビービトラ ム社販売） 。
    [0083] 以下、 本発明に使用する （ 1 → 3 ) — /3— D—グルコシ ド構 造体の調製法についてさらに詳細に説明する。
    [0084] 本発明に使用する （ 1 → 3 ) — S— D—グルコシ ド構造体は、 例えば、 以下の調製例に示す方法により調製できる。 また、 巿 販品の （ 1 → 3 ) — S— D—グルカンのうち、 本発明の範囲に あるものは、 そのまま使用することが出来る。
    [0085] 調製例 1 ： 市販カー ドランからの分子篩クロマ ト分画に
    [0086] よる調製
    [0087] 力一 ドラ ン （和光純薬工業、 試薬、 Lot No. PEQ 9080、 Mn > 136, 000 、 w/Mn> 2. 7 6、 試料 No. 1 0 1 )の i gを 0. 3 MNaOH に 5 mgZ の濃度に溶解して、 1 0 0 〃 ^づっ、 室温下、 以下 の条件下でゲルパー ミ エイ シヨ ンク ロマ ト グラフィ ー （以下
    [0088] G P C )を行なった。 {カラム ： TSKgelG6000PWXLと G5000PWXL (ともに 7. 8 X 3 0 0 mm)とを直列に連結、 移動相 ： 0. 3 MNaOH, 流速 ： 0. 5 me/ i } 。 溶出してきた低分子画分（Να 4 4〜 4 6 ) を採取し、 再クロマ トグラフィーにかけ、 数平均分子量が 3, 050- 多分散度が 1. 2 9の試料 0. 0 1 5 mgを得た （試料 Να 1 ) 。 上記 G P C分画パタ一ンを添付の第 2図に示す。 更に第 2図中 44 〜4 6画分を再クロマ トした分画パターンを添付の第 3図に示 す。
    [0089] 本試料 Να 1 を； 8— 1， 3 —グルカナーゼ （ザィモリエイス— 1 0 0 Τ、 生化学工業販売） で消化し、 該酵素消化液を G P C (カラム ： TSKgeIG4000PWXL、 G3000PWXい G2500PWXL直列 ； 移 動相 ： 蒸留水、 流速 ： 0. 6 mS/ in) で分析し、 酵素消化液中の 糖組成 （グルコース 4 0 %、 ラ ミナリ ビオ一ス 3 0 %、 ラ ミナ リ ト リ オース 2 0 %、 ラ ミ ナリテ トラオース 8 %、 ラ ミ ナリベ ン夕オース 2 %、 回収率 9 4 %) が確認出来た。 このことから 本試料 （Να 1 ) の糖構造は （ 1→ 3 ) —；8— D—グルコシ ド構 造部分を含有する —ポリ グルコシ ドであることがわかる。
    [0090] 調製例 2 ： カー ドランの水に対する溶解度差による分画
    [0091] 市販カー ドラン （試料 Να 1 0 1 ) 5 0 gを蒸留水に懸濁し、 下記のフ口一シー トに示す操作により分画を行った。
    [0092] 試料 Να 1 0 1 ( 5 0 g ) /蒸留水 2. 5 _β
    [0093] I
    [0094] 攪拌、 室温下、 1 時間
    [0095] 遠心分離 （16， 000 x g、 2 0分） 蒸留水 2. 5 £
    [0096] 1 ~~沈 澱 '上 清 （約 2. 5 ^ X 2 )
    [0097] (洗液）
    [0098] 洗 净 減 £h 濃 縮
    [0099] 限外濾過膜濾過 （ 0. 2 2 / m) 水不溶性糖画分 透過液 1 0 τηβ
    [0100] 試料 Να 1 0 2
    [0101] 4 8. 3 g 凍 結 乾 燥 0.0076 g
    [0102] 水可溶画分 試料 Να 2
    [0103] 調製例 3 ： カー ドラン水不溶性糖画分のギ酸分解による調製
    [0104] 試料 ffo 1 0 2の 4 5 2を1：. O g a w a らの方法 [Carbohydr. Res., 2 9 , 3 9 7〜 4 0 3 ( 1973) ] によりギ酸分解を行つ た。 操作内容を下記のフローシー トに示す。
    [0105] 試料 Να 1 0 2
    [0106] 4 5 g 1 0分を要し添加
    [0107] ~~ 9 0 %ギ酸 1 £ ( 8 5〜 9 0 °C)
    [0108] [
    [0109] 攪拌 2 0分 （ 8 5〜 9 0 °C)
    [0110] 濾過 （グラスフィルター G 3 )
    [0111] P P t 濾 液
    [0112] 蒸留水 減圧乾固
    [0113] 1 H
    [0114] ボイル 2 hr…脱ホルミル化
    [0115] I
    [0116] 減圧乾固
    [0117] 蒸留水-
    [0118] 500
    [0119] 再懸濁
    [0120] グラスフィルター G 4
    [0121] 濾過 水不溶性画分 液
    [0122] 3 2. 5 6 g
    [0123] 試料 Να 4 凍結乾燥
    [0124] 水可溶性画分 0. 2 1 g
    [0125] 試料 Να 3
    [0126] 調製例 4 — 1 : カー ドランギ酸分解物水可溶性画分の分子篩 による再分画
    [0127] 先に示した調製例 3で得た水可溶性画分 （試料 Not 3 ) 0. 1 5 gを蒸留水 3 0 m こ溶解し G P C (カラム ： TSKgelG3000PWXL X 2、 G2500PWXLx l、 移動相 ： 蒸留水、 流速 0. 5 ^/min) に より各 0. 5 宛分画採取し、 再クロマ トにより分子量の異なる 6種の試料 （Να 1 1〜 1 6 ) を得た。
    [0128] 調製例 4 一 2 ： カー ドランギ酸分解物水不溶性画分の分子篩 による再分画 調製例 3で得た水不溶性画分 （試料 Να 4 ) の 0. 2 gを 4 0 mi の 0. 3 MNaOH 溶液に溶解し、 GPC (力ラム ： TSKgelG3000PWXL x 2、 G2500PWXL 1 、 移動相 ： 0. 3 MNaOH 溶液、 流速 5 md / min)を用い上記調製例 4 一 1 と同様の操作にて分画、 再クロマ トを行い溶出液に 0. 3 MHC^溶液を加えて中和し、 分子量の異 なる 2種の試料 （No.1 7及び 1 8 ) を得た。
    [0129] 調製例 5 ： カー ドラン水不溶性画分からの音波処理による
    [0130] 試料の調製
    [0131] 試料 Να 1 0 2の 1 gを約 1 0 0 i の 5 m NaOH溶液に懸濁し、 氷冷下音波発生機、 ソニケ—ター TM (大岳製作所、 型式 5202PZT、 東京） により 2 0 KHz 、 8 0 Wで 1 2分間音波処理により低分 子化を行った。
    [0132] 処理液を 5 M NaOHを用い、 最終 0. 3 M NaOH溶液とし、 上 記調製例 4 一 2に準じクロマ ト分画を行い分子量の異なる 8種 類の試料 （Να ΐ 9〜 2 2及び 1 0 3〜 1 0 6 ) を得た。
    [0133] 調製例 6 - 1 : 海藻由来の阻害物質の調製 （ I )
    [0134] ァラ メ (Eisenia bicyclis) 由来の試料は、 T. U s u i ら Agric. Biol. Chem. 4 3 , 6 0 3〜 6 1 1 ( 1979) の方法に従 い市販ァラメ乾燥藻体 （東京、 吹田商店） 1 0 0 gを粉砕後、 8 0 %エタノールにより低分子可溶画分を抽出除去し、 残渣か ら、 2 %CaC^ 2 水溶液を用いラ ミ ナラ ン画分を抽出する。 次 いで該抽出液にエタノール 9 5 %を用い終濃度 7 5 %溶液とし、 生じた沈澱を遠沈により集め、 エタノール洗浄後、 粗ラ ミ ナラ ン試料を得る。 該粗試料を蒸留水に再溶解し、 陰イオン交換体 (D E A E— トヨパール） により夾雑する酸性物質 （アルギン 酸等） 及び色素類を除き、 エタノール再沈澱から試料 Να 2 5を 得た。
    [0135] 調製例 6— 2 : 海藻由来の阻害物質の調製 （ ]!)
    [0136] マコンブ Laminar ia japonica由来の試料は J. J. Connellら、 J. Chem. So ， 3494(1950) の方法に従い、 市販マコンブ乾燥 藻体 （東京、 吹田商店） 1 0 0 gを粉砕後、 0.0 9 M HC 溶 液にて約 3 日間静置抽出し、 不溶物を濾別し、 濾液を更に 1 日 静置し、 生ずる少量の沈澱を遠心分離により除去し、 上清に 3 倍容のエタノールを加え、 約 7 5 %溶液とし、 生ずる沈澱を遠 沈により集め、 アルコール洗浄、 乾燥後水溶性ラ ミナラン画分
    [0137] (試料 Not 2 7 ) を得た。
    [0138] 調製例 7 - 1 : 真菌由来の阻害物質の調製 （ I )
    [0139] 真菌 Sclerotinia libertiana (ナタネ菌核病菌） 由来の試料 スク レ口タンは、 北原ら、 岐大農報 _ _、 1 0 0〜 1 0 5 (1957) の方法に従って Sclerotinia libertianaの菌核の脱脂乾燥粉末 ( 3 0 g) を水で充分に抽出して得た残渣を 7 %NaOH溶液で抽 出し、 抽出液に 1 0 %CuS04 溶液を加えて沈澱させ、 これを濾 別して塩酸酸性メ夕ノールで洗浄して銅を除き、 8 0 %メ夕ノ ールで洗浄して HC^を除き、 メタノール、 エーテルで洗浄乾燥 することを 3回鑤返して精製し、 6 gの試料 Να2 8を得た。
    [0140] 調製例 7— 2 : 真菌由来の阻害物質の調製 （H)
    [0141] 真菌 Schizophyllum commune (スェヒロタケ） 由来の試料は、 市販シゾフィ ラ ン （科研製薬 ： 商品名ソニフイ ラ ン、 医薬品 ： Lot Να J61040)を K. T a b a t aら、 Carbohydr. Res. , 8 9
    [0142] 1 2 1〜 1 3 5 ( 1981) の方法に従い前記調製例 5の操作に準 じ、 水溶液中 1 0時間音波処理後、 アルカ リ条件下分子篩分画 により分子量の異なる 3種類の試料 （Να29, 30, 3 1 ) を得た。 調製例 7 — 3 ： 真菌由来の阻害物質の調製 （m)
    [0143] 酵母 Saccharomyces cerevisiae (ノ、°ン酵母） 由来の y3—グル カ ン試料は、 市販パン酵母グルカ ン（シグマ社 Lot Na56F-4027) 9 O mgに蒸留水 5 0 ^を加え、 室温で 2時間攪拌後、 遠心分離 上清約 5 0 m6を、 減圧濃縮により 1 とし不溶物を再度遠心除 去し、 上清から 0. 6 4 mgの試料 （Na 3 3 ) を得た。
    [0144] 調製例 8 ： 大麦/ 5—グルカ ン由来の試料の調製
    [0145] 市販大麦^―グルカン （シグマ社、 Lot No.5 6 F - 0652) を
    [0146] 0. 3 M NaOHにより 5 mg/ ιηβの溶液とし、 前記調製例 4一 2に 準じアル力 リ条件下、 分子篩分画により分子量分布の狭い /3— グルカ ン試料 （Να 3 6 ) を得た。
    [0147] また、 上記市販の大麦 /S—グルカンを 5 mgノ の濃度にて熱 水に溶解し、 その遠心 （ 3, 500rpm、 1 0分） 上清を前記調製例 4一 1 に準じて蒸留水を移動相として 1 0 0 〃 づっ 5 0回 G P C分画採取し、 更に同条件下にて再分画採取して分子量の 異なる 2種の試料 （試料 No.3 7， 3 8 ) を得た。
    [0148] 調製例 9 ： 部分カルボキシメチル化 （ 1 → 3 ) - β — Ό —グル 力ン （置換度 D S = 0. 6 3 ) の調製
    [0149] 調製例 2に準じて得た力一 ドラン水不溶物を A. E. Clarke and B. A. Stone :P ytochemistry 丄， 1 7 5〜 1 8 8 (1962") の方法に準じて、 カルボキシメチル化した。 即ち、 1 0 0 の カー ドラン水不溶物を窒素気流下 0でで 1 ^の 5 M苛性ソ一ダ 水溶液に溶解し、 これを攪拌しながら 2 3 6 gのモノ クロル酢 酸を 2 0 0 τ ^の水に溶解したものを滴下して加え、 添加後、 60 〜 6 5でで 2時間攪拌する。 生ずるゲルを 2. 5倍容のエタノー ル中で強く攪拌し細粉化し濾過する。 7 0 %のエタノールで充 分洗滌してからエタノール、 エーテルで洗滌し乾燥する。 この ものを水 7 ^に溶解し、 1 M酢酸で中和し、 活性炭 4 0 gを加 え、 室温で 1 時間攪拌し、 濾過する。 濾液を減圧濃縮して 1 ^ とし、 3倍容のエタノールを加えて沈澱とし、 エタノール、 ェ 一テルで洗滌し、 濃硫酸上減圧乾燥し、 113.85gを得た。
    [0150] 得られた部分カルボキシメチル化 （ 1→ 3 ) — /8— D—グル カンは、 D.F.Dursoの硝酸ゥラニル法 [Methods in Carbohydrate Chem. H, 1 2 7〜： I 2 9 ( 1980) 参照] に従って測定すると エーテル化度 （置換度 ： Degree of Substitution:DS)は 0. 6 3 であった。 これは糖鎖を形成しているグルコース残基 1個当り の置換し得る水酸基 3個のうちの 0. 6 3個が置換されたことを 意味するものである。
    [0151] 得られた部分カルボキシメチル化 （ 1→ 3 ) — β - Ό— ゲル カ ンの 2 5 mgを 5 τηβの 0. 1 Μ酢酸アンモニゥム水溶液に溶解し、 G P C (カラム ： トヨパール HW 6 5 F、 5 x 1 0 0 cm ; 移動 相 ： 0. 1 M酢酸ァンモニゥム水溶液 ； 流速 ： 5. 8 Zmin)によ り分画採取し、 別のカラムを用いた G P C (カラム ： TSK gelG 6000PWXL + G5000PWXL + G3000PWX Lを直列に使用 ； 移動相 ： 0. 1 M酢酸ァンモニゥム水溶液 ； 流速 ： 0. 6 Zmin)により再 分画採取し、 分子量分布の狭い試料 Να 4 1 (Μπ=231,000)を得 た。
    [0152] また、 部分カルボキシメチル化 （ 1→ 3 ) - β - Ώ -グルカ ンの 0· 3 gを蒸留水 3 0 に溶解し、 音波処理 （ 9 kHz 、 180 〜 130W、 1 時間、 音波発生機として久保田製作所、 Insonat or Model 201M使用） により低分子化した後、 そのうち 4. 5 に 0. の 1 M酢酸ァンモニゥム水溶液を加えて混和後、 上記 の試料 Να 4 1 を得るための操作と同様な操作にて、 G P C分画 採取および G P C再分画採取を行い、 分子量の異なる 2種の試 料 （Να 3 9， 4 0 ) を得た。
    [0153] 調製例 1 0 ： 置換度 1. 2の部分カルボキシメチル化 （ 1 → 3 )
    [0154] — /3— D—グルカ ンの調製
    [0155] 調製例 9 によって得られた置換度 （D S ) 0. 6 3のカルボキ シメチル化 （ 1 → 3 ) - β - Ό -グルカン 1 0 gを窒素気流下 0てで 2 5 m6の 1 0. 5 M NaOHに加えてペース トとしょく攪拌 しながら、 それにモノ クロル酢酸水溶液 （ 1 0 1 を 加え、 6 0 °Cに加温し、 4時間攪拌し、 冷却してから 2 M HC 3 0 を加え、 次いで 2 0 07 ^の塩酸酸性エタノール （ 4 0 HC エタノール） 中に注いで生ずる沈澱を集め、 7 0 %エタ ノールで洗滌後、 エタ ノール、 エーテルで洗滌し、 減圧乾燥し、 試料 No.1 0 7の標品を得た。
    [0156] 調製例 9に示した D S = 0. 6 3の部分カルボキシメチル化 ( 1 → 3 ) 一 ー D—グルカンと同様の方法で置換度を測定し た結果このものは D S = 1. 2 0であった。
    [0157] 調製例 1 1 ： 部分カルボキシメチル化ラ ミナラ ンの調製
    [0158] 部分力ルボキシメチル化ラ ミナランは Laminaria digitataの ラ ミナラ ン （シグマ社 Lot No.7 7 F - 3885) を用い、 調製例 9 の部分カルボキシメチル化法と同様、 A. E. Clarke and B. A. Stone:Phytochem. 丄， 1 7 5 (1962)に記載の方法に準じ調製 し、 試料 N(X 4 2 ( D S = 0. 0 6 ) の標品を得た。
    [0159] 調製例 1 2 ： 部分メチル化 （ 1→ 3 ) — ^— D—グルカ ンの 調製
    [0160] 調製例 2に準じて得た力一 ドラン水不溶物 3. 0 gを M. Samec,
    [0161] Kolloid-Beihef te 5 し 3 6 9 ( 1940) の方法に従い、 水 80 に懸濁し、 窒素気流下、 飽和苛性ソーダ水溶液 1. 3 5 を加 え、 完全に溶解させ、' 4でで、 ここにジメチル硫酸 6 0 gを徐 々に加え、 約 1 時間後、 アセ トン中に反応液を滴下し、 生ずる 沈澱を集め、 アセト ンで充分洗滌し、 濃硫酸上減圧乾燥し、 標 記調製品 （試料 Να 4 3、 D S = 0. 1 6 ) の 3. 1 3 gを得た。
    [0162] 調製例 1 3 ： 部分硫酸化ラ ミナランの調製
    [0163] Laminaria digitataラ ミ ナラ ンの硫酸エステル化はピリ ジン 中でピリ ジン— 3酸化硫黄複合体 （和光純薬工業、 Lot NaPPL 8823) を用いて次の如く行った。
    [0164] 充分に乾燥した aminaria digitataのラ ミナラン （シグマ社、 Lot Να 7 7 F - 3885) 0. 5 gを 5 0 の脱水ピリ ジンに溶解し， ピリ ジン— 3酸化硫黄複合体 1 gを加え、 6 0でで 1 時間反応 させ、 水 1 0 を加え、 冷却し、 苛性ソーダで中和し、 あら かじめアル力 リ水溶液で充分洗滌してグルカンを除去した透析 膜 （スぺク トロポア 1,000 カツ ト） を用いて水に対して透析し た後、 濃縮し、 2倍容のアセ ト ンを加えて糖成分を沈澱せしめ- ァセ ト ンで洗滌後、 濃硫酸上減圧乾燥し、 0. 3 8 gの標記調製 品を得た （試料 No.4 4、 D S = 0. 1 4 ) 。
    [0165] なお、 調製例 1 2〜 1 3に示した各標品のメチル基及び硫酸 基の置換度は、 下記文献①、 ②の方法に従い測定算出した。
    [0166] ① 落合、 津田、 阪本 ； 有機定量分析法 （微量篇） 、 南山堂
    [0167] (1956) ；
    [0168] ② Whistler, R. L. ed. , Methods in Carbohydrate Chemistry 111、 p 2 2 9〜 2 3 5 , 2 7 7〜 2 8 0 ( 1964) ヽ Academic Press
    [0169] [市販試料]
    [0170] 下記市販試料は物性を確認後、 そのまま又はアルカ リ可溶化 後中和し、 測定に供した。
    [0171] グルコース ： （和光純薬工業、 J I S特級試薬） ·· 試料 Να108 ラ ミ ナリオリゴ糖 ： （生化学工業、 ピュア一試薬） ： 試料
    [0172] 5〜 1 0
    [0173] ラ ミ ナラ ン Eisenia araborea由来 ： （半井化学、 試薬） ： 試料 Να 2 3
    [0174] " arabor_ea由来 ： （東京化成、 試薬） ：
    [0175] 試料 Noi 2 4
    [0176] " Laminaria digitata由来 ： （シグマ社、 試薬） ： 試料 Να 2 6
    [0177] レ ンチナン Lentinus edodes (シィタケ） 由来 ： （味の素、 医薬 Lot Να 9 Z 0 1 L S ) ： 試料 Να 3 2
    [0178] リ ヒェナン Cetraria_islaj^ica由来 ： （シグマ社、 試薬） ： 試料 Να 3 4
    [0179] " Usnea barbata 由来 ： (シグマ社、 試薬） ： 試料
    [0180] Να 3 5
    [0181] 上記の各試料の分子量、 G因子活性化阻害力価等の測定結果 を下記表一 1 に示す。 表— 1
    [0182] G因子活性化 試料 Να 物 質 名 調 製 法 糖鎖構造" Μη2, Mw/Mn 阻 害 力 価
    [0183] (単位/ mg)
    [0184] 1 力一ドラン G PC分画画分 調製例 1 (1) 3, 050 1.29 1,000, 000
    [0185] 2 力 —ドラン水可溶物 調製例 2 (1) 3, 270 2.49 2, 240， 000
    [0186] 一ドランギ酸分解物
    [0187] 3 水溶性画分 調製例 3 (1) 2.080 1.90 10, 700, 000
    [0188] 4 ノ 土 ΙΗΙ Γ nl¾*ciyリ《5 l) i 1 η ππUπU o. iy o 4， UUU
    [0189] C
    [0190] 5 ラミナリビオース 市販品 （生化学工業） （1) 342 ' 214
    [0191] 6 ラミナリ トリオース 市販品 （生化学工業） （1) 504 4, 670
    [0192] 7 ラミナリテトラオース 市販品 （生化学工業） （1) 667 20, 000
    [0193] 8 ラミナリペン夕オース 市販品 （生化学工業） （1) 829 39, 800
    [0194] 9 ラミナリへキサオース 市販品 （生化学工業） （1) 991 55, 000
    [0195] 10 ラミナリへプタオ一ス 市販品 （生化学工業） （1) 1, 153 103, 000
    [0196] 1 (続き）
    [0197] G因子活性化
    [0198] Μπ f ) Μη 2)
    [0199] ΎΜin 暂. 3 m m 據銷機 1 ivi w / ivi n I HJB 宝舌 ノ "f Ji 雷
    [0200] (単位/ mg)
    [0201] 7- ― に 1 ノノ、ノゼ Blfe< 胖ft2iin
    [0202] 11 ϋ V) Cし1 T "ίάΰ ιάχχ fq制 Λ
    [0203] T 1 s
    [0204] 1 Β周製 15¾ 4 1、 Δ, o 07ilf>) 11. nu Uo, UUU
    [0205] 1
    [0206] 12 GPC分画画分 2 調製例 4 (1) 3,400 1.20 13， 400, 000
    [0207] 13 GP C分画画分 3 調製例 4 (1) 4.800 1.20 20, 000, 000
    [0208] C
    [0209] 14 GP C分画画分 4 調製例 4 (1) 5, 800 1.20 31, 600, 000
    [0210] 15 G P C分画画分 5 調製例 4 (1) 6,800 1.20 6, 310, 000
    [0211] 16 G PC分画画分 6 調製例 4 (1) 9.800 1.22 3, 980,000
    [0212] 17 G PC分画画分 7 調製例 4一 2 (1) 14.500 1.24 1,820, 000
    [0213] 18 G PC分画画分 8 調製例 4一 2 (1) 27, 500 1.26 126, 000
    [0214] 表一 1 (続き）
    [0215] G因子活性化 試料 No. 物 質 名 調 製 法 糖鎖構造 " Mn2) Mw/Mn 阻 害 力 価
    [0216] (単位 Zmg) 力-一ドラン音波処理物
    [0217] 19 G P C分画画分 1 調製例 5 (1) 20, 700 1.27 646, 000
    [0218] 20 G P C分画画分 2 調製例 5 (1) 28, 300 1.18 389, 000
    [0219] 21 G P C分画画分 3 調製例 5 (1) 50, 200 1.26 4, 900
    [0220] 22 G PC分画画分 4 調製例 5 (1) 58, 100 1.29 234
    [0221] 00
    [0222] 表一 1 (続き）
    [0223] G因子活性化 試料 Να 物 質 名 調 製 法 糖鎖構造 " Mn2) Mw/Mn 阻 害 力 価
    [0224] (単位 /mg) ラ ミナラン
    [0225] 23 Eisenia araborea由来 市販品 （半井化学） (2) a) 16, 800 1.49 6,760
    [0226] 24 Eisenia araborea由来 市販品 （東京化成） (2) a) 11,200 1.55 29, 500
    [0227] 25 Eisenia bicyclis由来 調製例 6— 1 (2) a) 22.500 1.27 64, 600
    [0228] 26 Laminaria digitata由来 市販品 （シグマ社） (2)b) 5,850 1.16 7, 080, 000 O
    [0229] 27 Laminaria japonica由来 調製例 6— 2 (2)b) 17, 700 3.98 39, 800
    [0230] 28 スクレ口タン 調製例 7— 1 (2)d) 16, 800 2.77 26, 300
    [0231] 表— 1 (続き）
    [0232] G因子活性化 試料 ffo 物 質 名 調 製 法 糖鎖構造' > Mn2). Mw/Mn 阻 害 力 価
    [0233] (単位/ ) シゾフイラン
    [0234] 29 G PC分画画分 1 調製例 7 - 2 (2)d) 6,750 3.14 138,000
    [0235] 30 G PC分画画分 2 調製例 7 - 2 (2)d) 23, 600 2.37 11,700
    [0236] 31 G PC分画画分 3 調製例 7 - 2 (2)d) 27, 500 1.49 50, 100
    [0237] 32 レンチナン 市販品 (2)d) 94, 700 1.46 10, 000 C
    [0238] (味の素）
    [0239] 33 パン酵母グルカン水可溶物 調製物 7 - 3 (2)e) 11, 600 5.14 11,500
    [0240] リヒェナン
    [0241] 34 Cetraria islandica由来 市販品 （シグマ社） (3) 22, 000 4.72 3, 550
    [0242] 35 Usnea barbata 由来 市販品 （シグマ社） (3) 23, 200 4.07 120
    [0243] 大麦/ 3—グルカン
    [0244] 36 G PC分画画分 1 調製例 8 (3) 54, 900 1.16 30, 900
    [0245] 37 G PC分画画分 2 調製例 8 (3) 129, 000 1.09 11,700
    [0246] 38 G PC分画画分 3 調製例 8 (3) 200, 000 1.13 40, 700
    [0247] 表一 1 (続き）
    [0248] G因子活性化 料 No. 物 質 名 調 製 法 糖鎖構造 1 Mn 2) Mw/Mn 阻 害 力 価
    [0249] (単位/ mg) 部分力ルボキシメチル化（1→3)
    [0250] 一 ^— D—グルカン （DS = 0.63)
    [0251] 39 G PC分画画分 1 調製例 9 (1) 42,400 1.14 117， 000
    [0252] 40 G PC分画画分 2 調製例 9 (1) 77, 300 1.10 91,200
    [0253] 41 G PC分画画分 3 調製例 9 (1) 231,000 1.10 80, 000
    [0254] 42 部分カルボキシメチル化 調製例 1 1 (2)b) 8, 170 1.21 3, 630, 000 ラミナラン
    [0255] 43 部分メチル化（1→3)— yS— D— 調製例 1 2 (1) 78, 200 1.10 93， 300 グルカン
    [0256] 44 部分硫酸化ラミナラン 調製例 1 3 (2)b) 10, 300 2.04 117.000
    [0257] 101 カードラン 市販品 (1) 136, 000く 2.76く 100>
    [0258] (和光純薬工業）
    [0259] 1 (続き)
    [0260] G因子活性化 試料 Να 物 質 名 調 製 法 糖鎖構造" Mn2) Mw/Mn 阻 害 力 価
    [0261] (単位/ mg)
    [0262] 102 カードラン水不溶物 調製例 2 (1) 159, 000く 2.50< 100>
    [0263] カードラン音波処理物
    [0264] 103 G P C分画画分 5 調製例 5 76, 300 1.26 100>
    [0265] 104 G P C分画画分 6 調製例 5 92, 600 1.23 100>
    [0266] 105 G P C分画画分 7 調製例 5 171,000 1.19 100〉
    [0267] C
    [0268] 106 G PC分画画分 8 調製例 5 216, 000 1.19 100> IS
    [0269] 107 部分カルボキシメチル化（1→3) 調製例 1 0 329, 000く 1.27く 100>
    [0270] — /8— D—グルカン （DS-1.20)
    [0271] 108 グルコース 市販 C3
    [0272] 180 100>
    [0273] 1 ) 糖鎖構造の記号は、 明細書に記載した分類記号を表わす。
    [0274] 2) グルコースおよびラミナリオリゴ糖は絶対分子量 （理論値） 。 他は別記の分子量測定法により求めた
    [0275] ポリエチレンォキシドおよびポリエチレングリコ一ル換算値。
    [0276] 表中の分子量は前記ゲルパーミエイショ ンクロマ トグラフィ 一 （以下 G P Cと略記することがある） により求めた下式で定 義される数平均分子量 （Mn) で表し、 また、 分子量分布は、 下 式で定義される多分散度 （Mw/Mn)で表わす。
    [0277] ∑ H i
    [0278] 数平均分子量 （Mn) = -
    [0279] ∑ (H i /M i )
    [0280] ∑ (H i xM i )
    [0281] 重量平均分子量 （Mw) = -
    [0282] ∑ H i
    [0283] 多分散度=1^^"ノ1^ 11
    [0284] ただし、 Hiはクロマ トグラムを時間で等分に多分割したとき の i番目のピーク高さ （試料濃度） を、 Miは i番目の分子量を 表わす。
    [0285] G因子活性化阻害力価は下記に示す [G因子活性化阻害物質 の活性力価測定法] にて測定し mg当りの単位として示した。
    [0286] [G因子活性化阻害物質 （以下 G I と略記することがある） の活性力価測定法]
    [0287] 反応混合液 2 0 0 / ^中には以下のものを含む。
    [0288] (1) 検体 （注 1 ) G I試料又は純水 5 0 〃 ^
    [0289] [G因子活性化物質 （GAと略記、 注 2) ] 1 O pg添加又は 無添加
    [0290] (2) 力ブトガニライセ一 ト凝固酵素
    [0291] 前駆体画分 （ A28。 = 2. 5 ) (注 3 ) 3 0 /
    [0292] (3) 力ブトガニライセ一 ト G因子画分
    [0293] ( A 28。 = 0.9 ) (注 3 ) 2 0 〃
    [0294] (4) ト リス—塩酸緩衝液 （ρΗ8· 0 ) 2 0 mole (5) MgC 2 2 0 mole
    [0295] (6) Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 0. 1 3 n mole
    [0296] 上記反応液を 3 7でで 3 0分間ィンキュベー ト した後、 遊離 する pNA の量を 0.04%亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0. 4 8 M HC^溶液） 0· 3 %スルファ ミ ン酸アンモニゥム、 0. 0 7 %N— 1 -ナフチ ルェチレンジアミ ンニ塩酸塩のそれぞれ 0. 5 ^を順次加え、 ジ ァゾカップリ ングにより色調変換し、 5 4 5 nmにおける吸光度
    [0297] (A 545 )量として測定する。 G I活性は次式により算出する。
    [0298] [GI試料 （GA添加） の A 545 ] - [純水 （GA無添加） の A545]
    [0299] GI活性 （％) = 100 X 100
    [0300] [純水 （GA添加） の A 545 ] -
    [0301] [純水 （GA無添加） の A 545 ]
    [0302] この条件下において、 G Aによる G因子の活性化を 1 0 0 % 阻害する G I量を 1 0 0単位とする。
    [0303] (注 1 ) 検体のうち、 水不溶性のものは、 0. 3 M NaOHに溶か した後、 等容の 0. 3 M HC^を加えて中和して用いる。
    [0304] (注 2 ) 前記調製例 5で調製したカー ドラン音波処理物の GPC 分画精製標品 （表一 2、 Να 1 0 6、 分子量 216, 000)。 (注 3 ) 文献 [T. Obayasi et al. , Clin. Chim. Acta, 1 4 9 ,
    [0305] 5 5〜 6 5 ( 1985)]に従い日本産カブトガニ T. tridentatus から調製した。
    [0306] 上記の （ 1→ 3 ) — ^— D—グルコシ ド構造体を前記の方法 により不溶性担体に固定化して得られた本発明の不溶性固定化 物に、 次いで A Lを接触させる。 両者を接触させる場合の温 度としては通常 0〜 4 0で、 好ましく は 0〜 1 0で、 また pHと しては 6〜 8の範囲が用いられる。 続いて不溶性固定化物を L A Lから除く。 このためには両者の混合物から濾過や遠心分 離などによって不溶性固定化物を除く、 あるいは不溶性固定化 物を充填した力ラムに L A Lを通し、 通過した L A Lを得るな どの方法を用いることができる。
    [0307] L A Lと接触させる該不溶性固定化物の量は、 担体上に固定 化された （ 1→ 3 ) — /3— D —グルコシ ド構造体の G因子活性 化阻害作用の強さによつて異なるので、 例えば次のようにして 決定すればよい。 氷冷下、 一定量の L A Lに該不溶性固定化物 (エン ド トキシンを含有しないもの） を量を変えて接触させた 後、 遠心分離によって不溶性固定化物を除き、 これに対して通 常の測定条件下において L A Lを充分に活性化する一定量の G 因子活性化物質 （エン ドトキシンを含有しないもの、 またでき る限り G因子活性化阻害物質を含まないもの） を加え、 通常の L A L使用時と同条件で反応させる。 この条件下で L A Lの活 性化を 1 0 0 %阻害する該不溶性固定化物の量を求める。 次に、 上で求めた量の該不溶性固定化物と上記の一定量の L A Lとを 接触させた後、 更に G因子活性化物質の量を変化させて加えど の濃度で加えても L A Lが活性化されないことを確認する。 上 記の操作によって一定量の L A L中の G因子の活性化を完全に 阻害するのに必要な該不溶性固定化物の量を求めることができ 以下、 本発明の不溶性固定化物の調製法およびそれらを利用 してエン ド トキシンとのみ特異的に反応する L A Lの調製法を 具体例を挙げて述べる。 不溶性固定化物の調製は松本らの方法 (松本勲武ら、 特開昭 59-15401 ) に従って行った。 調製例 1 4 ： カー ドラ ンギ酸分解物 （Mn、 5, 800)固定化セル口 —スの調製
    [0308] セルロース粉末 （メ ッ シュ、 1 0 0〜 2 0 0、 東洋濾紙製造） 2 gをグラスフィルター上で水でよく洗浄後、 吸引濾過した後、 フラスコに入れ、 水 3 0 7» 、 2 M NaOH水溶液 1 3 7 ^およびェ ピクロルヒ ドリ ン 3 を順次加えて得られる懸濁液を 4 0 で 2時間振盪した後、 グラスフィルター上で充分洗浄してェポキ シ活性化セルロースを得た。 得られたエポキシ活性化セルロー ス 1容 （ 2 0 に 8 0 %ヒ ドラジン水化物水溶液 1. 5容 （30 を加え、 4 0 °Cで 1. 5時間振盪した。 反応後、 グラスフィ ルター上で水で充分に洗浄してヒ ドラジノセルロースを得た。 得られたヒ ドラジノセルロースのうち 2 g (湿重量） に調製例
    [0309] 4 - 1 で得たカー ドランギ酸分解物 （試料 Να 1 4、 Μη = 5, 800)
    [0310] 5 O mgと水素化シァノホウ素ナト リウム 2 6 mgとを 0. 2 MK2 HP04 水溶液 1. 5 に溶解したものを加え、 室温で 3 日間振盪した。 反応後、 グラスフィルター上で水 1 および 0. 2 M酢酸ナ ト リ ゥム水溶液 1 で順次洗浄した。 このものに 0. 2 M酢酸ナ ト リ ゥ厶水溶液 1. 0 ^を加えて懸濁液とし、 次いで、 無水酢酸 0. 5 ^を加え、 0 °Cで 3 0分間反応させた後、 更に無水酢酸
    [0311] を加え、 室温で 3 0分間処理して未反応のヒ ドラジン残基をァ セチル化した。 反応後、 水、 0. 1 M NaOH水溶液、 水、 リ ン酸 緩衝化生理食塩水 （ P B S ) で順次洗浄して、 カー ドラ ンギ酸 分解物固定化セルロースを得た。
    [0312] 調製例 1 5 ： ラ ミ ナラ ン固定化セルロースの調製
    [0313] セルロース （セル口ファイ ン、 G C— 7 0 0 — m、 生化学ェ 業販売） 2 0 g (湿重量） を調製例 1 4 と同様な操作によって ヒ ドラジン誘導体とした。 得られたヒ ドラジノセル口フ ァイ ン のうち 2 g (湿重量） に Laminar ia digi tataのラ ミ ナラン （シ グマ社販売、 Lot Να 7 7 F - 3885) 5 0 mgと水素化シァノホウ 素ナ ト リ ウム 2 6 mgとを 0. 2 MK2HP04 水溶液し 5 m£に溶解した ものを加え、 室温で 3 日間振盪した。 反応後、 調製例 1 4に準 じて洗净、 未反応のヒ ドラジン残基のァセチル化および洗浄を 行いラ ミ ナラン固定化セル口フアインを得た。
    [0314] 調製例 1 6 ： ラ ミナリ ビオース固定化親水性ポリ ビニル合成ポ リマーの調製
    [0315] トョパール （親水性ポリ ビニル合成ポリマ一、 HW5 5、 Fine, 東ソー販売） 1 kg (湿重量） を調製例 1 4 に準じて操作し、 ェ ポキシ活性化トョパールを得た。
    [0316] 得られたエポキシ活性化トヨパールのうち 8 0 0 m に、 アジ ピン酸ジヒ ドラジ ド 9 2 gを 0. 1 M Na2C03水溶液 1. 2 i に溶 解し、 塩酸で pHを 9に調整した溶液を加え、 4 0 °Cで一夜振盪 した。 反応後、 グラスフィルタ一上で 0. 2 M NaC 水溶液で 充分に洗浄して、 ヒ ドラジ ドトヨパールを得た。 得られたヒ ド ラジ ド トヨパール全量に、 ラ ミ ナリ ビオース （生化学工業販売、 Lot 8701100) 3 2 gと水素化シァノホウ素ナ ト リウム 1 0. 4 g とを 0. 2 M K2HP( 水溶液 6 0 0 ^に溶解したものを加え、 室 温で 3 日間振盪した。 反応後、 グラスフィルター上で、 水、 0. 2 M酢酸ナ ト リ ゥム水溶液で順次洗浄した。 このものに 0. 2 M酢酸ナ ト リ ゥム水溶液 4 0 0 、 次いで無水酢酸 2 0 0 を 加え、 0 °Cで 3 0分間振盪後、 更に無水酢酸 2 0 0 を加え室 温で 3 0分間振盪して、 未反応のヒ ドラジ ド残基をァセチル化 した。 反応後、 水、 0. 1 M NaOH水溶液、 水、 リ ン酸緩衝化生 理食塩水で順次洗净して、 ラ ミナリ ビオース固定化トョパール を得た。
    [0317] 〔図面の簡単な説明〕
    [0318] 第 1 図は、 力ブトガニ ， ァメボサイ ト · ライセー トに関する 凝固系の反応機構を示す図である。
    [0319] 第 2図は、 市販力一 ドラ ンの分子篩クロマ トによる分画パタ ーン （溶出曲線） を示す図であり、 〇印は G因子活性化阻害力 価 （左側、 縦軸） を示す、 △印は糖含量を示す。
    [0320] 第 3図は、 第 2図で得られた Να 4 4〜 4 6画分を再ク口マ ト した分画パターンを示す図であり、 〇印は G因子活性化阻害力 価 （左側、 縦軸） を示し、 △印は糖含量を示す。
    [0321] 第 4 一 1図は、 未処理の L A Lおよび本発明により処理した L A Lと各種濃度のェン ドトキシンとを反応させたときの吸光 度を示す図であり、 〇印は未処理 L A Lを示し、 △印は実施例 2により処理した L A Lを示す。
    [0322] 第 4 一 2図は、 未処理の L A Lおよび本発明により処理した L A Lと各種濃度の （ 1 — 3 ) — /5— D—グルカンとを反応さ せたときの吸光度を示す図であり、 〇印は未処理 L A Lを示し. Δ印は実施例 2により処理した L A Lを示す。
    [0323] 〔発明を実施するための最良の形態〕
    [0324] 実施例 1 ： カー ドランギ酸分解物固定化セルロースを用いた L A Lの調製
    [0325] 調製例 1 4で得たカー ドラ ンギ酸分解物固定化セルロース (湿体積 0. 4 をエン ド トキシンを除く ため、 グラスフ ィ ル ター上で 0. 1 M NaOH 1 _gおよび蒸留水 1 Hで順次洗浄後、 蒸留水を加えて 2. 6 の懸濁液とし、 これを用いてプレゲル一 M主剤 （ゲル化法リムルステス ト製品、 凍結乾燥品、 LotABOl 、 感度 0. 1 2 5 Έ υ τη , 生化学工業販売） 1 バイアルを溶解し た後、 毎分 3, 000 回転、 1 0分間遠心分離し、 上清 （L A L - 1 ) を得た。 この上清およびプレゲル一 Μ主剤を 2. の蒸留 水で溶解したもの （L A L— 2 ) のエン ドトキシン （E. coli 0111 ： B 4由来） および部分カルボキシメチル化 （ 1 → 3 ) — β - Ό—グルカン [調製例 9で得た資料 No.4 1 、 以下、 （ 1 → 3 ) — — D—グルカンと記す] に対する反応性をプレゲル— Mの標準操作法 （ 0. 1 の検体に 0· 1 τη の L A Lを加え、 3 7 でで 6 0分間静置、 加温する。 ） に従ってゲル化の有無で調べ た結果を表一 2に示す。 表中、 十、 一はゲル化の有無を表わす。 表一 2
    [0326] エン ドトキシン 0 12.5 25 50 100 200pg/^
    [0327] L A L - 1 ― ― ++ ++ ++
    [0328] L A L - 2 ― ― ― ++ ++ + +
    [0329] (1→3) _ 3— D—ダルカン 0, 1 1. 0 10 100 1, 000 10, 000ng/^
    [0330] L A L - 1 ― ― ― ― ― --
    [0331] L A L - 2 ― ― +十 ++ ― ― 表から明らかなように LAL— 1 はェン ドトキシンとのみ反応 する目的の LALである。
    [0332] 実施例 2 ： ラ ミナラ ン固定化セルロース （セル口フ j ン） 用いた L A Lの調製
    [0333] 調製例 1 5で得たラ ミナラン固定化セルロフアイ ン湿体積
    [0334] 0.4 をグラスフィルタ一上で、 0. 1 M NaOHl ^および蒸留 水 1 £で順次洗浄後、 蒸留水を加えて 4 ^とし、 このうち 0.2 に蒸留水 1.8 を加えた懸濁液をポリ ビニリデンフロライ ド 膜 （0.2 2〃m、 マイレクス GVフィルターユニッ ト、 日本ミ リ ポア工業販売、 Lot CE11) で濾過し、 ラ ミ ナラ ン固定化セ ルロファインが付着したフィルターを得た。 一方、 カブトガニ
    [0335] (Tachypleus tridentatus) の血リ ンパを採取し遠心分離 （毎 分 3, 000回転、 5分間）で血球 （約 2 0 g) を得、 これに 0 2 M Tris— HC^緩衝液 （pH8.0 ) 1 0 0 τ ^を加え、 ヮ一リ ング ' ブレンダ一でホモゲナイズした後、 遠心分離 （毎分 8, 000回 転、 3 0分間、 4 °C) により上清と沈澱物とに分画した。 この 抽出操作をもう一度繰り返し、 上清合計約 1 5 Οτ^を L ALと して得た。 この LALのうち 1 を上記のラ ミナラン固定化セ ルロファイン付着フィルターで濾過し、 濾液を得、 このうち 0. 0 4 に MgC^ 2 1.5〃 gおよび合成基質 （N— tert—ブト キシカルボニル— Leu -Gly - Arg — p—ニトロァニリ ド） 4.0 gを加えて凍結乾燥した。 この凍結乾燥品に 0.2 M
    [0336] Tris— HC ^緩衝液 （pH8.0 ) 0. 1 および検体 （実施例 1で使 用したエン ドトキシンあるいは （ 1→ 3 ) — ） S— D—グルカン の種々濃度の水溶液） 0. を加えて 3 7 °Cで 3 0分間加温し た後 0. 6 M酢酸 0. 4 ^を加えて反応停止し、 4 0 5 nmにおける 吸光度を測定した結果、 および未処理 L A Lを用いて同様に測 定した結果を第 4図に示す。 図中〇印は未処理 L A Lを使用し た場合の吸光度を、 △印はラ ミナラン固定化セル口ファイ ンで 処理した L A Lを使用した場合の吸光度を示す。 図から明らか なように、 ラ ミ ナラ ン固定化セル口ファイ ンで処理した L A L は （ 1 → 3 ) — /5— D —グルカンとは反応せず、 エン ドトキシ ンとのみ反応し、 これを使用することによってエン ドトキシン の特異的測定が可能である。
    [0337] 実施例 3 ： ラ ミナリ ビオース固定化トヨパールを用いた L A L
    [0338] の調製
    [0339] 調製例 1 6で得たラ ミナリ ビオース固定化トョパール湿体積 6 0 をグラスフィ ルター上で、 0. 1 M NaOH1500 および蒸 留水 1500 で順次洗浄後、 これに実施例 2 と同様な操作で得た 未処理 L A L 2 を蒸留水で 2 5倍希釈したものを加え、 4 °C で 3 0分間振盪後、 遠心分離 （毎分 3， 000 回転、 1 0分間） に より得た上清を凍結乾燥し、 これに蒸留水を加え、 とした。 このうち 0. 1 771 に、 実施例 1 と同様にエン ドトキシンあるいは ( 1→ 3 ) — β — Ό—ゲル力ンの種々濃度の水溶液 0. 1 を加 え、 3 7でで 6 0分間反応させた結果、 （ 1 → 3 ) — β - Ό一 グルカン （ 0. 1 〜10, 000ng/ ) ではゲル化せず、 一方ェン ド トキシン （ 1 0 O pgZ 以上） ではゲル化した。
    权利要求:
    Claims 求 の 範 囲
    1 . 式 〔 I〕
    (式中、 nは 2〜 3 7 0の数を表す）
    で示される （ 1→ 3 ) — /3— D—グルコシド構造体を不溶性担 体に固定化して得られる不溶性固定化物に、 カブトガニ ， ァメ ボサイ ト ■ ライセ一 トを接触させることを特徴とする実質的に G因子を含まないカブトガ二 . ァメボサイ ト · ライセ一 トの調 製法。
    2. 前記 （ 1→ 3 ) - β - Ό -グルコシド構造体 〔 I〕 力 、 該 構造体の構造部分に下記式 （ I) 、 (I) 、 (F) 、 (V) お よび （ΥΙ) からなる群から選択される構造単位の少なく とも 1 種の各構造単位の 1 つもしく はそれ以上が結合した構造体であ る請求項 1記載の調製法。
    式 （I) 式 （M)
    式 （W)
    式 （V)
    式 （VI)
    式 （W) 、 (V) 、 (VI) 中、 R, 、 R2 及び R3 の少なく とも 1つはメチル基、 ヒ ドロキシアルキル基、 カルボキシアル キル基、 ァセチル基、 硫酸基、 リ ン酸、 ァリル基から選択され る基またはそれらの金属塩、 アンモニゥム塩及び有機アミ ン塩 から選択される残基を表し、 そして残りは水素原子を表す。
    3. 前記 （ 1— 3 ) — /5— D—グルコシド構造体が、 アル力 リ ゲネス属 （Alcarigenes) バクテリア由来の （ 1→ 3 ) — β — D -グルカン、 鞭毛藻 （Euglena) 由来のパラ ミ 口ン、 高等植 物由来の ^ーグルカンまたは力ロース、 褐藻類由来のラ ミナラ ン類、 珪藻由来のク リ ソラ ミナラン類、 ブク リ ヨゥ菌由来のパ キマン、 Phytophthora (フィ トフソラ） の細胞壁由来のグル カ ン、 Sclerotinia (スク レロチニァ） 由来のスク レ口タ ン、 S chizophyllum (スェヒロタケ）由来のシゾフィ ラ ン、 Grifola frondosa (マイタケ） 由来のグリ フオラン L E、
    Sclerotium (スク レロチウム） 、 Corticium (コルチシゥ厶） 、 S tromatinia (ス トロマチニァ） 由来のスク レログルカ ン類、 L entinus (シィタケ） 由来のレ ンチナン、 S accharomyces (パン酵母） の細胞壁由来の /3—グルカン、 Cetraria (セ ト ラ リア） 、 Usnea (ウスネア） 、 E vernia (ェベルニァ） に由 来する リ ヒェナン類、 大麦胚乳中に含まれる /3—グルカンから なる群から選択される天然物由来のものであることを特徴とす る請求項 1 または 2記載の調製法。
    4. 前記 （ 1→ 3 ) — S— D—グルコシ ド構造体が、 糖鎮を酸 またはアルカ リ、 /S—グルカナーゼを用いる加水分解、 加酢分 解、 音波処理からなる群から選択される部分的分解および有機 溶媒または塩類を用いる分別沈殿、 分子篩剤および分子篩膜か らなる群から選択される分別処理により分画されたものである ことを特徴とする請求項 3に記載の調製法。
    5. 前記不溶性担体が、 セルロース、 ァガロース、 架橋デキス トラン、 ポリアク リルア ミ ド、 多孔質ガラスまたは親水性ポリ ビニル系合成ポリマーのヒ ドラジン誘導体またはヒ ドラジ ド誘 導体であることを特徴とする請求項 1記載の調製法。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Hahn et al.2012|Novel procedures for the extraction of fucoidan from brown algae
    Fenoradosoa et al.2010|Extraction and characterization of an alginate from the brown seaweed Sargassum turbinarioides Grunow
    Ishii et al.1996|Isolation and characterization of a boron-rhamnogalacturonan-II complex from cell walls of sugar beet pulp
    Hosono et al.1997|Characterization of a water-soluble polysaccharide fraction with immunopotentiating activity from Bifidobacterium adolescentis M101–4
    Freimund et al.2003|A new non-degrading isolation process for 1, 3-β-D-glucan of high purity from baker's yeast Saccharomyces cerevisiae
    Song et al.2012|Structure characterization and antitumor activity of an α β-glucan polysaccharide from Auricularia polytricha
    Srivastava et al.1989|Bioactive polysaccharides from plants
    Mescher et al.1976|Purification and characterization of a prokaryotic glycoprotein from the cell envelope of Halobacterium salinarium.
    Darvill et al.1980|The primary cell walls of flowering plants
    Huang et al.1998|Studies on polysaccharides from three edible species of Nostoc | with different colony morphologies: comparison of monosaccharide compositions and viscosities of polysaccharides from field colonies and suspension cultures
    McNeil et al.1980|Structure of plant cell walls: X. Rhamnogalacturonan I, a structurally complex pectic polysaccharide in the walls of suspension-cultured sycamore cells
    Gorin et al.1968|Galactomannans of Trichosporon fermentans and other yeasts; proton magnetic resonance and chemical studies
    Filippov1992|Practical infrared spectroscopy of pectic substances
    Horan et al.1986|Purification and characterization of extracellular polysaccharide from activated sludges
    Robyt et al.1963|Action pattern and specificity of an amylase from Bacillus subtilis
    Signini et al.1999|On the preparation and characterization of chitosan hydrochloride
    Liu et al.2016|Structural properties of polysaccharides from cultivated fruit bodies and mycelium of Cordyceps militaris
    Zvyagintseva et al.2000|Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds
    Moreau et al.1990|Structure of the type 5 capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus
    Casu et al.1981|The structure of heparin oligosaccharide fragments with high anti-| activity containing the minimal antithrombin III-binding sequence Chemical and13C nuclear-magnetic-resonance studies
    Amelung2001|Methods using amino sugars as markers for microbial residues in soil
    Šandula et al.1999|Microbial |-β-D-glucans, their preparation, physico-chemical characterization and immunomodulatory activity
    Crini et al.2008|The removal of Basic Blue 3 from aqueous solutions by chitosan-based adsorbent: Batch studies
    Wang et al.2004|Chemical components and molecular mass of six polysaccharides isolated from the sclerotium of Poria cocos
    Hasegawa et al.1969|Enzymes that hydrolyze fungal cell wall polysaccharides I. Purification and properties of an endo-α-D-|-glucanase from Trichoderma viride
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JP3122454B2|2001-01-09|
    EP0507952A1|1992-10-14|
    DE69123834T2|1997-05-15|
    EP0507952B1|1996-12-27|
    EP0507952A4|1992-08-07|
    US5401647A|1995-03-28|
    JPH04134265A|1992-05-08|
    DE69123834D1|1997-02-06|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    JPH01503808A|1987-07-16|1989-12-21|||
    JPH02186267A|1988-09-01|1990-07-20|Seikagaku Kogyo Co Ltd|Limulus amebocyte lysate g factor interfering agent|EP0588303A1|1992-09-14|1994-03-23|Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha |Reagent for endotoxin-specific assay|
    EP0649021A1|1993-09-30|1995-04-19|Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha |Reagent for endotoxin-specific assay|JPS6152125B2|1976-11-18|1986-11-12|Takuma Sasaki||
    JPS5944705B2|1978-01-13|1984-10-31|Olympus Optical Co||
    JPH03399B2|1982-08-05|1991-01-07|Seikagaku Kogyo Co Ltd||
    JPH0711523B2|1988-03-16|1995-02-08|和光純薬工業株式会社|試薬の調製方法|
    CA1328074C|1988-09-01|1994-03-29|Shigenori Tanaka|Horseshoe crab amebocyte lysate factor g inhibitor|EP0490995A1|1989-09-08|1992-06-24|Alpha Beta Technology|Method for producing soluble glucans|
    JP3242733B2|1993-02-26|2001-12-25|生化学工業株式会社|エンドトキシン特異的測定剤|
    US5866150A|1996-03-20|1999-02-02|Aquaculture Technology Incorporated|Antibacterially active extracts from the marine algae chaetoceros and methods of use|
    DE69734046T2|1996-10-21|2006-06-14|Seikagaku Kogyo Co Ltd|Verfahren zur Bestimmung von Endotoxin|
    US6270982B1|1997-10-09|2001-08-07|Charles River Laboratories|Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins|
    AU6261999A|1998-09-25|2000-04-17|Collaborative Group, Ltd., The|Very high molecular weight beta-glucans|
    US6369216B1|1998-09-25|2002-04-09|Biopolymer Engineering Pharmaceutical, Inc.|Very high molecular weight β-glucans|
    WO2004014320A2|2002-08-13|2004-02-19|Biopolymer Engineering, Inc.|Methods of using beta glucan as a radioprotective agent|
    US20060165700A1|2002-09-04|2006-07-27|Ostroff Gary R|Cancer therapy using whole glucan particles and antibodies|
    EP1539194A4|2002-09-04|2007-06-13|Univ Louisville Res Found|Cancer therapy using beta glucan and antibodies|
    JP5118849B2|2003-03-17|2013-01-16|チャールズリバーラボラトリーズ，インコーポレイテッド|微生物夾雑物の検出のための方法および組成物|
    US7197521B2|2003-11-21|2007-03-27|Intel Corporation|Method and system performing concurrently mark-sweep garbage collection invoking garbage collection thread to track and mark live objects in heap block using bit vector|
    EP1842069A2|2004-12-02|2007-10-10|Charles River Laboratories, Inc.|Methods and compositions for the detection and/or quantification of gram positive bacterial contaminants|
    US7479375B2|2005-01-13|2009-01-20|Charles River Laboratories, Inc.|Method for classifying a microorganism in a biological sample|
    CA2607004C|2005-05-05|2016-01-26|Sensient Flavors Inc.|Production of beta-glucans and mannans|
    WO2009137244A1|2008-04-15|2009-11-12|Charles River Laboratories, Inc.|Cartridge and method for sample analysis|
    CU24073B1|2011-12-27|2015-01-29|Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem|COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS|
    CN105431534B|2013-08-02|2017-10-24|优瑞纳股份有限公司|内切－1，3－β－葡聚糖酶、多核苷酸、重组载体、转化体、内切－1，3－β－葡聚糖酶的制造方法、酶制剂及低分子化裸藻淀粉的制造方法|
    US9901606B2|2016-06-09|2018-02-27|Algaeon, Inc.|Euglena lysate composition|
    WO2019142760A1|2018-01-16|2019-07-25|株式会社Adeka|ヒアルロニダーゼ活性阻害剤|
    法律状态:
    1992-04-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1992-04-16| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1992-05-27| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1991917028 Country of ref document: EP |
    1992-10-14| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1991917028 Country of ref document: EP |
    1996-12-27| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1991917028 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP25520190A|JP3122454B2|1990-09-27|1990-09-27|カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法|
    JP2/255201||1990-09-27||US07/859,411| US5401647A|1990-09-27|1991-09-27|Method of preparing Limulus amoebocyte lysate|
    DE1991623834| DE69123834T2|1990-09-27|1991-09-27|Verfahren zur herstellung von limulus amöbozytenlysat|
    EP19910917028| EP0507952B1|1990-09-27|1991-09-27|Process for preparing limulus amoebocyte lysate|
    [返回顶部]